本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法。
背景技术：
随着现代社会文明的不断发展，生活节奏加快，工作、学习、生活压力的增加，导致更多的人出现失眠，失眠症表现为入睡困难、睡眠不连贯、中途醒来后无法继续入睡，易造成患者疲劳、情绪紊乱、生理节奏错乱以及择业困难等危害，严重影响患者的生活质量，上述症状持续超过6个月称为慢性失眠。失眠不仅降低患者生活质量，还耗费大量医疗资源。
研究表明失眠与抑郁症紧密相连。失眠是抑郁症的残留症状和复发的危险因素。目前针对慢性失眠症的治疗主要包括药物(包括西药中药)与非药物治疗方法，传统镇静催眠药物治疗失眠症虽然疗效好、见效快，但药物不良反应明显。非药物治疗包括认知行为以及中医非药物治疗等，治疗过程复杂，疗效不是很确切。寻找慢性失眠的简单有效的治疗方法也是广大神经精神科医师努力探索的目标。神经-内分泌-免疫调节是一张相互联结并相互影响的网络系统，睡眠通过下丘脑-垂体-肾上腺系统(hpa)和交感神经系统(sns)调节免疫内环境的稳态，科学研究证实睡眠剥夺(partialsleepdepri-vation，psd)会导致自然杀伤细胞(nk细胞)、淋巴细胞等免疫细胞功能的下降，同时又会促进促炎细胞因子(il-6，tnf-a，crp)的释放，从而导致人体免疫功能受损；免疫内环境受损刺激hpa和sns产生较多的儿茶酚胺类激素以及大量炎性因子加重睡眠障碍。研究证明大量的自身免疫性疾病的病人都同时伴有睡眠障碍，也提示免疫紊乱者体内的炎性因子释放对睡眠的影响。
睡眠是人体重要的生理需要，对人体正常的生理功能维持有及其重要的作用，人类1/3的时间在睡眠中度过。充足的睡眠是保护大脑细胞和人体免疫系统正常工作的前提条件。失眠后的机体反应是失眠本身作为一个应激源刺激身体内产生一个应激反应的过程。大多数免疫紊乱疾病都同时伴有失眠症状，失眠对疾病是一个加重的因素。另一个研究表明失眠患者存在免疫紊乱，表现在il-6，il-2炎性因子水平升高，同时外周血淋巴细胞及单核细胞等炎性细胞计数增加。
人脐带间充质干细胞是临床研究最广泛的。其临床作用主要表现在组织修复和免疫调节方面，慢性失眠患者体内产生大量的自由基引起大脑皮层神经元细胞的退化、变性、凋亡等损伤，脐带间充质干细胞作为干细胞可以分泌多种细胞因子，静脉移植入体内后可以趋化到组织细胞损伤区域产生细胞因子促进损伤组织的细胞修复。间充质干细胞另外一个重要的作用就是免疫调节，可以通过上调患者的treg细胞，降低患者体内因失眠引起的免疫细胞及炎性因子的增多，起到明显的抗炎和调节免疫作用。通过以上两种途径和作用间充质干细胞在慢性失眠患者的治疗上表现了很好的改善作用，静脉输注治疗可显著改善慢性失眠患者的睡眠质量和生活质量，移植后1个月起效，一次治疗作用可持续达1年之久。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法，它成功率高，方法简单，成本低廉。
本发明是这样实现的：治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
1)无菌条件下采集脐带后送往实验室；
2)把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉，包括动脉两条，静脉1条；
3)在玻璃瓶中剪碎，直接分装在60mm的培养皿中；
4)添加2ml培养基，混匀后，置37℃，5％co2饱和湿度孵箱内培养，过夜后添加1ml培养基；
5)48h半量换液，3～4d后全量换液，每3～4d换液；
6)15～20天后去除组织块，待原代细胞达到覆盖培养皿的60～80％后，给予1：2传代；
7)当细胞数量达到108时，用pbs冲洗2次后，滴加0.05％的ttypsin-edta液消化，后加培养基终止消化，制成1～3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示cd34阴性，cd109阴性，cd29和cd44阳性率均>95％；
8)检测eb病毒、巨细胞病毒、hiv病毒、乙肝病毒、支原体、需厌氧培养、真菌检测，必须均阴性，判定为合格，检测合格后冻存至-196度液氮罐中。
由于采用了以上技术方案，本发明通过对流程的改进创新，使人脐带间充质干细胞的分离培养更为简单高效，大大降低了成本。为治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞再生原理的深入研究提供基础条件。本发明简单易行，使用效果理想。
具体实施方式
本发明的实施例1：一种治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
1)无菌条件下采集脐带后送往实验室；
2)把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉，包括动脉两条，静脉1条；
3)在玻璃瓶中剪碎，直接分装在60mm的培养皿中；
4)添加2ml培养基，混匀后，置37℃，5％co2饱和湿度孵箱内培养，过夜后添加1ml培养基；
5)48h半量换液，3～4d后全量换液，每3～4d换液；
6)15～20天后去除组织块，待原代细胞达到覆盖培养皿的60～80％后，给予1：2传代；
7)当细胞数量达到108时，用pbs冲洗2次后，滴加0.05％的ttypsin-edta液消化，后加培养基终止消化，制成1～3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示cd34阴性，cd109阴性，cd29和cd44阳性率均>95％；
8)检测eb病毒、巨细胞病毒、hiv病毒、乙肝病毒、支原体、需厌氧培养、真菌检测，必须均阴性，判定为合格，检测合格后冻存至-196度液氮罐中。
本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
技术特征：
1.一种治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)无菌条件下采集脐带后送往实验室；
2)把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉，包括动脉两条，静脉1条；
3)在玻璃瓶中剪碎，直接分装在60mm的培养皿中；
4)添加2ml培养基，混匀后，置37℃，5％co2饱和湿度孵箱内培养，过夜后添加1ml培养基；
5)48h半量换液，3～4d后全量换液，每3～4d换液；
6)15～20天后去除组织块，待原代细胞达到覆盖培养皿的60～80％后，给予1：2传代；
7)当细胞数量达到108时，用pbs冲洗2次后，滴加0.05％的ttypsin-edta液消化，后加培养基终止消化，制成1～3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示cd34阴性，cd109阴性，cd29和cd44阳性率均>95％；
8)检测eb病毒、巨细胞病毒、hiv病毒、乙肝病毒、支原体、需厌氧培养、真菌检测，必须均阴性，判定为合格，检测合格后冻存至-196度液氮罐中。
技术总结
本发明公开了一种治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞的分离培养方法，将无菌条件下采集脐带后送往实验室；把脐带剪成小段，在玻璃瓶中剪碎，添加2ml培养基；过夜后添加1ml培养基；48h半量换液，3～4d后全量换液，每3～4d换液；15～20天后去除组织块，待原代细胞达到覆盖培养皿的60～80％后，给予1：2传代。本发明通过对流程的改进创新，使人脐带间充质干细胞的分离培养更为简单高效，大大降低了成本。为治疗慢性失眠的人脐带间充质干细胞再生原理的深入研究提供基础条件。本发明简单易行，使用效果理想。
技术研发人员：邹邦银;张明红
受保护的技术使用者：铜仁市泛特尔生物技术有限公司
技术研发日：.09.29
技术公布日：.02.14
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